Élimination de la bactérie Escherichia coli par l’ozone gazeux
Les bactériophages et l’ozone gazeux évoluent en tant qu’alternatives méritoires aux désinfectants conventionnels dans les applications post-récolte alimentaires. Ici, nous avons étudié l’efficacité de traitements séquentiels d’un bactériophage lytique et d’ozone gazeux, lors du refroidissement sous vide de produits frais, contre Escherichia coli O157:H7.
La contamination par les Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) est un problème de sécurité majeur dans l’industrie des produits frais. Cet agent pathogène est une cause importante d’éclosions de maladies d’origine alimentaire associées à E. coli aux États-Unis. Les souches d’E. coli sont des membres largement inoffensifs du microbiote gastro-intestinal ; ceux-ci jouent même un rôle bénéfique dans la digestion, la production de vitamines essentielles et l’élimination des micro-organismes nocifs par exclusion compétitive
Le chlore est le désinfectant le plus couramment utilisé en raison de son faible coût, de sa facilité de mise en œuvre et de sa capacité à minimiser la contamination croisée entre les lots de produits frais. Cependant, des préoccupations ont été soulevées en raison de l’utilisation excessive de chlore et de la formation possible de sous-produits cancérigènes dans l’eau de lavage chlorée.
Pourquoi utiliser l’ozone comme désinfectant ?
L’ozone gazeux est un désinfectant hautement oxydant qui, lorsqu’il est utilisé à des niveaux optimaux, entraîne une forte réduction microbienne (> 
3 log UFC g -1 de réduction). L’ozone a une large activité antimicrobienne.
En raison de sa courte demi-vie, l’ozone est produit sur place à partir d’oxygène et utilisé comme agent antimicrobien dans des conditions de traitement contrôlées. L’ozone se décompose facilement en oxygène sans laisser de résidus chimiques ; par conséquent, l’utilisation de l’ozone est une approche souhaitable pour la décontamination des produits frais.
Contrairement à la spécificité d’hôte des bactériophages, l’ozone gazeux a une capacité antimicrobienne plus large et peut inactiver à la fois les contaminants microbiens de surface et internalisés. Par conséquent, il a été émis l’hypothèse que la combinaison de bactériophages et d’ozone gazeux dans la décontamination des produits frais constituerait une stratégie d’intervention complète qui minimise le risque d’agent pathogène et la détérioration de la qualité du produit.
Résultats de la désinfection à l’ozone sur les feuilles d’épinards
Application du phage Escherichia OSYSP pour contrôler Escherichia coli O157:H7 B6-914 sur les feuilles d’épinards
L’effet du titre de phage contre une charge initiale élevée d’ E. coli O157:H7 B6-914 (7,3 log UFC g -1 ) a été évalué. L’application de suspensions de bactériophages sous forme de pulvérisation à 10 8 et 10 9 PFU g −1 sur des feuilles d’épinards a réduit le nombre d’ E. coli O157:H7 de 0,3 et 1,5 log UFC g −1 , respectivement, par rapport à la pulvérisation avec de l’eau peptonée tamponnée sans phage (BPW) (Fig. 1A ). L’application de phages a été évaluée plus en détail pour déterminer l’effet de la pulvérisation répétée (doublement) de phages, qui couvrait complètement les feuilles d’épinards, sur les réductions microbiennes. À la charge initiale de 7,0 log UFC g −1 E. coliO157:H7 B6-914, les applications de phages de manière significative ( P < 0,05) ont réduit le nombre d’ E. coli O157:H7 B6-914 de 1,9 et 2,3 log UFC g -1 à non répétitif (10 9 PFU g -1 ) et répétitif ( 2 × 10 9 PFU g -1 ) applications de pulvérisation de phages, respectivement, par rapport à la pulvérisation de BPW sans phage ; cependant, les réductions microbiennes dans ces deux traitements n’étaient pas significativement différentes ( P > 0,05) l’une de l’autre (Fig. 1 B).
Évolution des populations d’ Escherichia coli O157:H7 B6-914, inoculées sur des feuilles d’épinard, lorsque des suspensions d’Escherichia phage OSYSP ont été appliquées à différentes concentrations et volumes. ( A ) Effet des concentrations de phages. ( B ) Effet d’une pulvérisation bactériophage unique et répétée (doublement du volume de pulvérisation). Des réductions logarithmiques moyennes ont été obtenues à partir d’au moins 3 traitements indépendants. Différentes lettres sur les barres représentent une différence significative ( P < 0,05). La barre d’erreur indique ± erreur standard de la moyenne. Le spray Escherichia phage OSYSP a été appliqué à 10 8 , 10 9 ou 2 × 109 PFU g -1 épinards.
Application séquentielle de bactériophage et d’ozone gazeux contre Escherichia coli O157:H7 B6-914 sur feuilles d’épinards
Les traitements des feuilles d’épinard inoculées par un agent pathogène comprenaient les éléments suivants (Fig. 2 ) : (a) non traité avec un phage (témoin 1) ; (b) pulvériser avec BPW sans phage (contrôle 2); (c) pulvériser avec une suspension de phages ; (d) pulvérisation de phage suivie d’un traitement avec de l’ozone gazeux; et (e) pulvériser avec du phage-free-BPW suivi d’un traitement à l’ozone gazeux. Tous les traitements à l’ozone gazeux ont été effectués en conjonction avec un refroidissement sous vide, comme décrit dans les sections sur la méthodologie. Des expériences supplémentaires ont été menées pour évaluer l’effet de la taille de l’inoculum pathogène (environ 5 et 7 log UFC g -1 ) sur son inactivation par les traitements décrits précédemment. À 7,1 log UFC g -1 du niveau d’inoculum, la pulvérisation de BPW sans phage a diminué la population de pathogènes cibles de 0,6 log UFC g -1, par rapport aux échantillons témoins non traités inoculés (Fig. 2 A), mais cette réduction n’était pas statistiquement significative ( P > 0,05). Le traitement des feuilles d’épinard artificiellement contaminées avec la suspension de phages ou l’ozone gazeux de manière significative ( P < 0, 05) a diminué de manière significative le nombre d’ E. coli O157: H7 B6-914 de 1, 7 et 1, 9 log UFC g -1 , respectivement, par rapport au BPW sans phage. Cependant, les réductions logarithmiques moyennes des traitements aux phages et à l’ozone n’étaient pas significativement différentes ( P > 0,05). L’application séquentielle de phages et d’ozone gazeux a réduit le nombre viable d’E. coli O157:H7 B6-914 de 3,4 log UFC g -1, par rapport au BPW sans phage. Par conséquent, à l’inoculum élevé d’ E. coli O157:H7 B6-914, le phage, l’ozone et leurs applications séquentielles ont inactivé de manière significative E. coli O157:H7 B6-914 sur les feuilles d’épinards, et l’application séquentielle a provoqué un effet antimicrobien additif, et a été significativement ( P < 0,05) plus efficace que le traitement individuel par phage ou ozone.
Changements dans les populations d’Escherichia coli O157:H7 B6-914 appliqués sur des feuilles d’épinards à des niveaux d’inoculum élevés et faibles et traités avec le phage Escherichia OSYSP, l’ozone gazeux et des traitements séquentiels de phage suivis d’ozone gazeux. ( A ) Taille élevée de l’inoculum ; 10 7 UFC g -1 . ( B ) Faible taille d’inoculum ; 10 5 UFC g -1 . *La ligne pointillée indique la limite de détection. Des réductions logarithmiques moyennes ont été obtenues à partir d’au moins 3 traitements indépendants. Différentes lettres sur les barres représentent une différence significative ( P < 0,05). La barre d’erreur indique ± erreur standard de la moyenne. EscherichiaLe spray de phage OSYSP a été appliqué à 10 9 PFU g -1 d’épinards.
De même, les expériences précédentes ont été répétées sur des feuilles d’épinard inoculées avec E. coli O157: H7 B6-914 à un niveau d’inoculation de 5, 1 log UFC g -1 (Fig. 2 B). La population d’ E. coli O157:H7 B6-914 récupérée à partir des feuilles d’épinards traitées avec BPW (témoin) était très peu différente ( P > 0,05) de celle récupérée sur les feuilles inoculées non traitées. À ce faible niveau d’inoculum d’E. coli , le traitement par les phages et l’ozone gazeux, appliqués séparément, a considérablement réduit le nombre de bactéries sur les feuilles d’épinards de 2,0 et 3,5 log UFC g -1 , respectivement, par rapport au spray BPW sans phage. E. coliLa réduction de O157:H7 B6-914 avec le traitement à l’ozone gazeux était significativement ( P < 0,05) plus élevée que celle obtenue avec le traitement aux phages. L’application séquentielle de phage OSYSP suivie d’un traitement à l’ozone gazeux a produit l’inactivation la plus élevée et réduit le nombre d’ E. coli O157:H7 B6-914 sous la limite de détection de la méthode de dénombrement, c’est-à-dire < 1 log UFC g -1 . La comparaison des inactivations à partir de deux niveaux d’inoculum différents a montré que l’efficacité des traitements par phage, ozone et combinaison (phage suivi d’ozone gazeux) était significativement plus élevée ( P < 0, 05) au niveau d’inoculum inférieur que celles obtenues au niveau d’inoculum élevé.
Application d’ozone gazeux suivi de bactériophage contre Escherichia coli O157:H7 B6-914 sur feuilles d’épinards
L’ordre d’application des antimicrobiens et le niveau d’inoculum de l’agent pathogène ont été étudiés (Fig. 3 ). Les feuilles inoculées ont d’abord été traitées avec de l’ozone gazeux, puis suivies par l’application du bactériophage. À un niveau d’inoculation de 6,6 log UFC g -1 , l’ozone gazeux et les traitements séquentiels d’ozone gazeux suivis de bactériophages ont significativement diminué ( P < 0,05) le nombre d’ E. coli O157:H7 B6-914 viables de 1,8 et 5,2 log UFC g -1 , respectivement (Fig. 3A ). À un niveau d’inoculation de 5,3 log UFC g -1 , les réductions étaient plus prononcées (Fig. 3 B). À ce niveau d’inoculum inférieur, l’application d’ozone seule a réduit la présence d’ E. colisignificativement ( P < 0,05) de 3,1 log UFC g -1 . Aucun survivant n’a été détecté dans les applications séquentielles d’ozone suivies de phage. Les réductions microbiennes obtenues dans les traitements séquentiels étaient significativement plus élevées ( P < 0,05) que celles des traitements à l’ozone seul.
Changements dans les populations d’Escherichia coli O157:H7 B6-914 appliqués sur des feuilles d’épinards à des niveaux d’inoculum élevés et faibles et traités avec le phage Escherichia OSYSP, l’ozone gazeux et des traitements séquentiels d’ozone gazeux suivis par le phage Escherichia OSYSP. ( A ) Taille élevée de l’inoculum ; 10 7 UFC g -1 . ( B ) Faible taille d’inoculum ; 10 5 UFC g -1 . *La ligne pointillée indique la limite de détection. Des réductions logarithmiques moyennes ont été obtenues à partir d’au moins 3 traitements indépendants. Différentes lettres sur les barres représentent une différence significative ( P < 0,05). La barre d’erreur indique ±erreur standard de la moyenne. Un spray Escherichia phage OSYSP a été appliqué à 10 9 PFU g -1 d’épinards traités à l’ozone.
Effet de l’ozone gazeux sur l’infectiosité du bactériophage OSYSP
Des expériences ont été réalisées pour évaluer l’effet du traitement à l’ozone gazeux sur l’inactivation du bactériophage OSYSP lors de traitements séquentiels sur des feuilles d’épinard (Fig. 4 ). Lorsqu’il est appliqué au temps zéro (inoculum de phage humide) ou 1 h après la pulvérisation de phage (inoculum de phage sec), le traitement à l’ozone gazeux a réduit de manière significative le nombre de bactériophages OSYSP ( P <0, 05) de 2 , 7 log PFU g -1 comme indiqué. Il n’y avait pas de différence significative ( P > 0,05) entre les traitements à l’ozone gazeux en ce qui concerne le temps d’application du phage sur les feuilles d’épinard. De plus, le phage, l’ozone gazeux et leurs traitements séquentiels n’ont pas affecté la qualité visuelle des feuilles d’épinard, comme l’ont observé les chercheurs de l’étude (Fig. 5 ).
Modifications du titre OSYSP du phage Escherichia (log PFU g −1 ) sur les feuilles d’épinard lorsque l’ozone gazeux a été appliqué à différentes phases de l’application du phage : Ozone appliqué immédiatement après la pulvérisation du bactériophage (0 h, inoculum de phage humide) ou 1 h après la pulvérisation du phage (sec inoculum de phage). Des réductions logarithmiques moyennes ont été obtenues à partir d’au moins 3 traitements indépendants. Différentes lettres sur les barres représentent une différence significative ( P < 0,05). La barre d’erreur indique ± erreur standard de la moyenne.
Effet des traitements sur la qualité visuelle des feuilles d’épinard. ( A ) Produits frais non traités, ( B ) zéro temps après l’application du phage, ( C ) une heure après l’application du phage, ( D ) après des traitements séquentiels à l’ozone et au phage.
